UJI KUALITATIF DAN KUANTITATIF DNA

UJI KUALITATIF DAN KUANTITATIF DNA

Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA (deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiap organisme.

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode  spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif.

Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Selanjutnya, lokasi DNA dalam gel tersebut dapat diidentifikasi secara langsung dengan menggunakan pewarna berfluorescen. Sedangkan pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri Vis (visible), spektrofotometri UV (ultraviolet), Spektrofotometri UV-Vis (ultraviolet–visible) dan Spektrofotometri Infra Red Dalam tulisan ini, hanya akan dijelaskan mengenai spektrofotometri Vis dan UV–Vis.

Uji kuantitatif DNA  dengan metode spektrofometri ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dan jumlah DNA di dalam suatu larutan contoh uji dan untuk memahami penggunaan  dan perbedaan spektrofotometer Vis dan UV-Vis.

Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan  dengan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif DNA dengan metode spekrofotometri. Spektrofotometri merupakan suatu  metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain :

1.    Spektrofotometri Vis (Visible)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua  cahaya  yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia dapat dilihat oleh mata, maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visible). Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram  merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya, karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Alat ini bekerja berdasarkan hukum Lambert-beer. Logika prinsip dari alat  spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang  diserap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang diserap. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.

2.    Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet-Visible)

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel  keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.

Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna  juga untuk sample tak berwarna.
DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada   280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. Jika nilai melebihi 2.0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan dari protein membran/senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1.8 maka ddH₂O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit. Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri UV-Vis antara lain : mikropipet, kuvet,  nanodrop  spektrofotometer dan seperangkat komputer. Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan aquadest sebagai blanko. Cara kerja pengujian kuantitatif DNA diawali dengan menghidukan alat nanodrop spektrofotometer. Kemudian melakukan uji blanko menggunakan aquadest. Setelah itu dilanjutkan dengan menguji isolat DNA dengan cara meneteskannya  pada  tempat sampel sebanyak 1 mikroliter. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan baca hasil kemurnian DNA-nya.

Terima Kasih sudah berkunjung di blog labbiomolekuler ini... Dalam blog ini akan Kami share segala sesuatu seputar biologi molekuler Kami pun menyediakan segala keperluan laboratorium biologi molekuler (khususnya) dan laboratorium umum...

Untuk info lebih lanjut, silahkan kunjungi link di bawah ini :

	www.biosm-indonesia.com