ISOLASI DNA

ISOLASI DNA

DNA merupakan asam nukleat yang berada di dalam dan/atau di luar inti sel (nukleus). Substansi ini dimiliki oleh semua organisme hidup (virus pengecualian). Peran DNA secara umum di dalam sel adalah sebagai materi genetik, dengan kata lain DNA menyimpan blueprint bagi setiap aktivitas sel. Materi genetik tersebut adalah suatu faktor pembawa sifat organisme yaitu gen. Gen dapat diidentifikasi dan direkayasa apabila telah diambil dari sumbernya yaitu DNA. Gen pun dapat ditransfer dari individu satu ke individu yang lain. Proses ini adalah manifestasi dari proses yang dinamakan isolasi DNA.

Isolasi DNA adalah proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu visualisasi DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik, rekayasa gen, dan amplifikasi DNA. Terdapat tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan dalam prosedur isolasi DNA ini, yaitu preparasi ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease) dan RNA (dengan RNAse). Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut yaitu kemurnian DNA, panjang DNA, kemampuan dipotong oleh sembarang enzim, tidak mengalami modifikasi selama proses isolasi berlangsung. Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.

Isolasi DNA adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi sel. Teknik ini diawali dengan perusakan dinding sel (tumbuhan) dan lisis membran sel yang merupakan upaya pemecahan sel, serta presipitasi DNA yang akan dipisahkan (purifikasi DNA). Perusakan dinding sel biasanya menggunakan nitrogen cair yang memiliki suhu -169˚C. Penggunakan nitrogen cair ini dimaksudkan untuk membekukan sel, setelah sel beku lalu sel dirusak (digerus) sampai benar benar halus dengan mortar agar dinding sel rusak. Lisis membran sel yaitu proses untuk meluruhkan membran sel pada nukleus. Teknik ini umumnya dilakukan menggunakan larutan deterjen kationik yaitu CTAB. Hal ini dikarenakan waktu isolasi yang relatif cepat serta tahapan metode yang relatif lebih mudah. Bufer CTAB merupakan detergen kationik  yang dapat melisis membran sel dan mampu mengendapkan polisakarida serta senyawa-senyawa fenolik. Penggunakan CTAB berfungsi untuk mengurangi kontaminan, mengurangi browning dan untuk menjaga DNA agar tidak rusak. Komponen-komponen yang terkandung dalam bufer CTAB adalah Tris-Cl, EDTA, NaCl, CTAB, PVP, dan merkaptoetanol. Tris-Cl berfungsi untuk mendenaturasi protein. NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat DNA. EDTA berfungsi sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan selubung sel secara keseluruhan. Larutan CTAB, PVP, dan  merkaptoetanol berfungsi untuk mendegradasi senyawa-senyawa metabolit sekunder sekaligus mengurangi browning akibat oksidasi.

Pemurnian (purifikasi) DNA bertujuan untuk menghilangkan beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein. Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA dilakukan menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol, asam asetat, dan enzim RNAse. Senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi mendenaturasi protein sedangkan enzim RNAse berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut. Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan menggunakan isopropanol dingin yang bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul sekaligus memisahkannya dari garam-garam mineral sisa CTAB. Pelet hasil presipitasi oleh isopropanol ini dibersihkan menggunakan alkohol 70 %. Pemurnian ini merupakan tahapan paling penting dalam Isolasi DNA. Karena bila ada kontaminan selain DNA maka hasil isolasi DNA yang dilakukan diangap gagal. Kontaminasi ini dapat menurunkan kualitas DNA hasil isolasi dan mengakibatkan data yang didapat tidak valid.

Reagent-reagent yang umum digunakan dalam teknik isolasi DNA yaitu Nitogen Cair, Polyvinyl Pyrrolidone (PVP), Bufer CTAB, Mercaptoethanol, CHISAM, isopropanol dingin, bufer Tris-EDTA (TE), RNAse, dan ethanol 70%. Sedangkan alat-alatnya adalah sebagai berikut, yaitu Mortar dan Pestle, Tabung Nitrogen, Tube Eppendorf 1,5 ml atau 2 ml, mikropipet, oven, freezer, mesin elektrofotometer, mesin spektrofotometer, mesin sentrifuse, pipet tip 1000 µl dan 20 µl.

kami pun menyediakan segala keperluan laboratorium patologi anatomi (khususnya) dan laboratorium umum...

Untuk info lebih lanjut, silahkan kunjungi link di bawah ini :

www.biosm-indonesia.com