DNA marker molekuler : RAPD

DNA marker molekuler : RAPD

Deteksi dan analisis variasi genetik dapat membantu kita untuk memamhami dasar molekuler dari fenomena variasi yang terjadi pada organisme hidup, mulai dari adanya varietas,spesies dan keragaman lainnya. Salah satu teknik yang umum digunakan untuk melihat adanya keragaman genetis dari suatu individu adalah DNA marker molekuler seperti RAPD, RFLP, SSR dan AFLP. Teknik ini ruitn digunakan dalam ilmu ekologi, evolusi, taksonomi, filogenik dan genetika. Salah satu teknik yang sering digunakkan adalah RAPD dan teknik lain yang akan dibahas pada tulisan selanjutny.

RAPD atau Random Amplified of Polymorphic DNA merupakan suatu metode yang dikembangkan dari teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Berbeda dengan PCR standar pada umumnya dimana produk amplifikasi telah ditentukan baik panjang maupun urutan basanya. Pada RAPD, urutan basa, ukuran produk amplifikasi dan lokasi penempelan primer tidak perlu untuk diketahui.

RAPD marker telah menjadi salah satu nuclear DNA marker biasa digunakan untuk menganalisis keragaman genetik (polimorfisme) dari suatu individu organisme, untuk melakukan pemetaan gen, melihat populasi genetik, evolusi molekuler genetik dan untuk aplikasi lebih jauh RAPD dapat digunakan sebagai acuan dalam proses persilangan tanaman atau hewan ternak.

Prinsip

Dalam RAPD digunakan primer  oligonukleotida tunggal pendek (10 pb) yang akan menempel secara sembarang (single arbitrary primer) pada banyak lokus berbeda yang ada pada kromosom organisme target dan akan mengamplifikasi sekuen fragmen acak dari DNA genomik. Pada PCR standar, posisi penempelan primer spesifik telah ditentukkan sehingga produk hasil amplifikasi akan spesifik dan urutan serta ukuran basa telah diketahui sedangkan pada RAPD sekuen target tidak diketahui. Primer ini menempel pada lokasi yang tidak diketahui namun tetap ada dalam aturan yaitu berada pada lokasi yang memungkinkan antara primer yang satu dengan primer yang lain bisa saling berhadapan dalam jarak yang tepat agar bisa menghasilkan produk (Gambar b).
 


 

(a) Ilustrasi Standar PCR

(b) Ilustrasi RAPD

Deskripsi (b): Primer 1,2,3,4,5 dan 6 memiliki urutan basa yang sama ; Untuk menghasilkan produk amplifikasi primer yang berdekatan harus berada dalam rentang jarak yang tepat.

Untuk mengetahui keragaman genetik dari beberapa individu spesies atau varietas spesies yang berbeda biasanya dilakukan analisis keragaman dengan menggunakan teknik RAPD. Hasil RAPD DNA genomik dari individu yang berbeda-beda dimasukkan ke dalam gel elektroforesis untuk kemudian di visualisasi dibawah sinar UV. Setiap satu sumur elektroforesis merepresentasikan keragaman genetik suatu individu. Ketika suatu individu memiliki perbedaan keragaman genetik dengan individu yang lainnya, maka akan terlihat adanya pita elektroforesis yang unik atau berbeda dari individu yang lain. Terjadinya perbedaan ukuran pita elektroforesis ini diakibatkan oleh lokasi penempelan primer yang berbeda (perubahan priming sites). Dari hasil analisis SCAR marker (Sequenced characterized Amplified Region marker) atau hasil RAPD yang telah dikarakterisasi pada penelitian terdahulu, diketahui bahwa salah satu sebab terjadinya polimorfisme RAPD adalah perubahan susunan basa kromosom akibat mutasi seperti delesi atau insersi.

Profil yang unik dari pita elektroforesis dapat menunjukkan keragaman genetik dari suatu spesies

                                                               

Tahapan yang dilakukan untuk RAPD

1.      Ekstraksi DNA genomik

Metode manual/konvensional : Isolasi DNA Genomik menggunakan metode CTAB

Metode Automatis : Kit Isolasi DNA genomik (recommended product)

2.      PCR

Komponen PCR premix (recommended products) :

Template DNA, primer, Taq Polymerase, enzim buffer, MgCl₂, dNTPs

Komponen PCR master mix (recommended products) :

 Template DNA, primer dan Master Mix (Taq Polymerase, enzim buffer, MgCl₂, dNTPs)

3.      Analisis : Elektroforesis

-          Gel elektroforesis

-          TAE/TBE Buffer

-          DNA Marker

-          Loading Dye

-          EtBr/Red Safe

-          Alat : Iluminator UV

Sumber :

Kumar, N. Senthil & Gurusubramanian, G. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) marker and its apllications. Sci Vis, 11(3):116-124, July-September 2011.