Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular.

PCR didasarkan pada penggunaan kemampuan DNA polimerase untuk mensintesis strand baru DNA komplementer dari strand DNA template. DNA polimerase hanya dapat menambahkan sebuah nukleotida ke dalam kelompok 3'-OH yang sudah ada sebelumnya. Untuk itu, dibutuhkan suatu primer sehingga DNA polimerase dapat menambahkan nukleotida dari nukleotida pertama. Primer yang digunakan tersebut adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen terhadap DNA template-nya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.

PCR adalah teknik  yang sangat berharga dalam penelitian biologi molekuler. Teknik ini digunakan sehari-hari di laboratorium di seluruh dunia dalam berbagai macam aplikasi hilir seperti kloning, analisis ekspresi gen, genotipe, sekuensing, dan mutagenesis. Beberapa kegunaan dalam aplikasi tersebut adalah :

1.    Amplifikasi urutan nukleotida

2.    Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi

3.    Bidang kedokteran forensik

4.    Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print

Adapun komponen-komponen yang diperlukan dalam reaksi PCR antara lain :

1.  Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi

2.  DNA template yang merupakan DNA target yang akan diamplifikasi

3.  Taq polymerase dan DNA polymerase dengan suhu optimum sekitar 70˚C

4.  Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) yang merupakan suatu blok tempat dimana DNA polimerase mensintesis untai DNA baru

5.  Bufer PCR menyediakan lingkungan yang cocok untuk aktivitas optimum dan stabilitas DNA polimerase. Bufer ini mengandung ion Mg²⁺ yang sangat mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas reaksi.

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya keadaan ini dilakukan antara 20-40 siklus. Target DNA yang diinginkan (short ”target” product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier. Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada akhir siklus PCR dapat dihitung secara teoritis menurut rumus:

Y = (2n– 2n)X

Ket :   Y : jumlah amplicon

n  : jumlah siklus

X : jumlah molekul DNA templat semula

Jika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka jumlah amplicon yang diperoleh pada akhir proses PCR adalah 1.074 x 109. Dari fenomena ini dapat terlihat bahwa dengan menggunakan teknik PCR dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen DNA yang diinginkan (amplicon) secara eksponensial dalam waktu relatif singkat.

Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu:

(1) pra-denaturasi DNA templat;

(2) denaturasi DNA templat;

(3) penempelan primer pada template (annealing);

(4) pemanjangan primer (extension),dan

(5) pemantapan (post-extension).

Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan proses PCR dapat dilihat sebagai berikut :

Terima Kasih sudah bekunjung di blog labbiomolekuler ini...

Dalam blog ini akan Kami share segala sesuatu seputar biologi molekuler

Kami pun menyediakan segala keperluan laboratorium biologi molekuler (khususnya) dan laboratorium umum...

Untuk info lebih lanjut, silahkan kunjungi link di bawah ini :