Amplified Fragment Length Polymorphisms

AFLP :

Amplified Fragment Length Polymorphisms

AFLP merupakan teknik analisis DNA marker yang dapat diketakan paling superior dibandingkan dengan teknik analsis DNA marker lain dikelasnya seperti RAPD, RFLP, SSR dan mikrosatelit dari segi efisiensi, reabilitas dan resolusi hasil fingerprinting. Sama seperti teknik analisis DNA marker lainnya, teknik ini digunakan untuk skrining keragaman genetik. AFLP merupakan salah satu DNA Marker yang cenderung menghasilkan dominant marker dibanding dengan co-dominant marker. Aplikasi umumnya lebih baik dilakukan menggunakan AFLP adalah pathotyping, populasi genetik, DNA fingerprinting dan QTL mapping namun AFLP kurang baik dalam mengidentifikasi marker homologis (ales) dan tidak presisi dalam menentukkan bagian alel seperi analisis heterozygositi.Penanda AFLP terbentuk dari adanya perbedaan panjang fragmen yang terpotong oleh enzim restriksi akibat dari adanya Single Nucleotide Polymorphism (SNP) atau adanya insersi/delesi pada basa genom.

^a Skema penetuan skor ini berdasarkan Hillis et al. dan Karp & Edwards

^b Marker AFLP akan mudah dilakukan dengan bantuan genotyper automatis atau ketika menggunakan gel elektroforesis beresolusi rendah atau elektoforesis menggunakan polyacrilamide

Alur pengerjaan analisis AFLP marker

Tahapan AFLP : Pemotongan dan pemasangan sekuens adaptor ; amplifikasi selektif

 

(a)    Sejumlah kecil DNA (~50 ng) dicerna oleh 2 enzim restriksi

(b)   AFLP adaptor diligasikan pada ujung sekuens yang terpotong enzim restriksi

(c)    Ligasi adaptor dilakukan bersamaan dengan enzim restriksi seperti ligasi fragmen-ke-fragmen yang kemudian dipotong ulang oleh enzim restriksi. Adaptor didesain sehingga ligasi dari fragmen ke adaptor tidak mengharuskan adanya penyusunan kembali area restriksi. Ujung sekuens dari setiap fragment yang dipsang adaptor akan mengandung sekuens adaptor (sekuens berwarna merah) dan akan ada bagian yang tertingggal dari sekuens restriksi (basa berwarna hijau dan biru). Ujung sekuens yang diketahui ini berperan sebagai  penempelan primer  dalam tahapan selanjutnya yaitu proses AFLP-PCR atau amplifikasi selektif.

Hasil amplifikasi selektif ini sangat bergantung pada ukuran sampel  genom, karena pada proses restriksi-ligasi akan dihasilkan ribuan fragmen yang ditempeli adaptor. Hasil penempelan adaptor ini akan divisualisasi menggunakan elektroforesis dan hanya fragmen yang mengandung adaptor yang akan teramplifikasi. Untuk mendapatkan amplifikasi selektif dari fragmen ini, primer diperpanjang kedalam bagian fragmen yang tidak diketahui (basa yang digaris bawahi). Biasanya satu sampai tiga basa dipilih secar acak dibelakang daerah pengenalan restriksi. Proses amplifikasi selektif ini pertama dilakukan dengan pemanjangan basa tunggal diikuti oleh lebih banyak lagi primer selektif sampai 3 panjang basa. Primer dibedakan hanya oleh basa tunggal dalam pemanjangan AFLP marker ini sehingga amplifikasi selektif dapat dicapai. Panjang dari proses pemanjangan ini akan bervariasi sesuai dengan ukuran genom dan akan menghasilkan jumlah produk yang optimal (pita). Tidak adanya smear pada hasil elektroforesis atau ko-migrasi pita yang baik selama proses elektroforesis akan menghasilkan informasi yang memadai sebagai data untuk analisis AFLP ini sehingga akan diketahui  fraksi atau pemecahan genom yang representatif.

Bagaimana hasil analisis AFLP dinilai?

Produk AFLP-PCR bisa dipisahakan dan dinilai mulai dengan menggunakan gel elektroforesis sederhana hingga genotyping automatis menggunakan automatis genotyper. Poliakrilamide gel elektroforesis juga banyak digunakan untuk menyediakan resolusi maksimum dari pola pita AFLP hingga tingkat perbedaan panjang nukleotida tunggal untuk dinilai dari gel agarosa.

 

 

Analisis fragmen menggunakan genotyper automatis

 

Realibilitas atau tingkat kepercayaan hasil AFLP

Karena AFLP merupakan dominant marker , penanda atau marker multilokus yang dinilai dari ada/tidaknya fragmen, kegagalan amplifikasi dari suatu fragmen akan mengurangi kepercayaan dari hasil AFLP. Keberadaan artifak fragmen atau smear pada gel yang kemungkinan berasal dari tahap restriksi-ligas. Maka, untuk meningkatkan reabilitas hasil AFLP pemotongan enzimharus terjadi secara sempurna agar tidak terjadi amplifikasi lanjutan dari fragmen yang tidak terpotong. Pemotongan enzim yang sempurna dapat dihasilkan dari kualitas DNA yang tinggi dan konsentrasi enzim restriksi yang tepat namun pada proses PCR seringkali dihasilkan artifak dan artifak ini dapat diminimalisir oleh suhu annealing primer yang tinggi, dimana suhu annealing primer AFLP cenderung tinggi. Hal ini ditujukan untuk menghindari mispiriming dari data analisis nilai AFLP dari tes duplo menunjukkan rata-rata eror dari analisis ini adalah 0-2%.

Tahapan AFLP dan bahan material yang dibutuhkan

Tahapan	Nama produk	Brand
Isolasi DNA	Genomic DNA Extraction Kit	Macherey-Nagel
Pemotongan enzim restriksi	Restriction enzyme (EcoR1, etc.)	Sigma-Aldrich
PCR	REDTaq® ReadyMix™ PCR Reaction Mix	Sigma-Aldrich
	2xPCR Master mix Solution (i-pfu)	Intron
Elektroforesis	Agarose [High Resolution, DNAse/RNAse-free]	Sigma-Aldrich
	Polyacrylamide	Sigma-Aldrich

*untuk informasi produk lebih lengkap silahkan kunjungi wesite kami www.biosm-indonesia.com

Sumber :

Mueller, Urich & L. L. Wolfenbarger. AFLP Genotyping and fingerprinting. TREE vol. 14, no. 10 October 1999

NCBI.  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechAFLP.shtml