Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

Reverse Transcription PCR (RT-PCR) adalah salah satu dari banyak varian teknik PCR. Teknik ini biasanya digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk mendeteksi tingkat ekspresi RNA. Sering terjadi kesalah pahaman di antara pelajar dan peneliti dengan definisi RT-PCR ini yang menganggap bahwa RT-PCR adalah Real-Time PCR (qPCR). Padahal kedua jenis teknik PCR ini sangatlah berbeda. Sementara RT-PCR digunakan untuk mendeteksi secara kualitatif ekspresi gen melalui penciptaan komplementer transkrip DNA (cDNA) dari RNA, qPCR digunakan untuk mengukur secara kuantitatif amplifikasi DNA menggunakan probe ber-fluoresense. RT-PCR pun berbeda dengan teknik PCR biasa walaupun keduanya sama-sama menghasilkan jutaan salinan DNA melalui amplifikasi. RT-PCR digunakan untuk mengkloning gen yang diekspresikan oleh transkripsi RNA target menuju DNA komplemen (cDNA) menggunakan reverse transcriptase. Kemudian, cDNA baru diamplifikasi menggunakan PCR biasa.

Sejak diperkenalkan tahun 1977, Northern blot  telah digunakan secara ekstensif untuk kuantifikasi RNA meskipun dengan berbagai kelemahannya seperti :

·      Memakan waktu banyak,

·      Memerlukan sejumlah besar RNA untuk deteksi, dan

·      Secara kuantitatif tidak akurat untuk RNA dengan konsentrasi rendah

Namun, penemuan reverse transcriptase selama studi replikasi virus dalam acuan material genetika telah mengarahkan para peneliti dalam pengembangan RT-PCR yang kemudian menggantikan teknik Northern blot sebagai metode pilihan untuk deteksi RNA dan kuantifikasi. Teknik RT-PCR telah meningkat menjadi patokan teknologi untuk deteksi dan/atau perbandingan tingkat RNA untuk beberapa alasan:

·       Tidak memerlukan proses PCR awal,

·       Dapat mengukur berbagai rentang kelimpahan RNA (>107 flip/lipatan), dan

·       Menyediakan data kualitatif dan kuantitatif.

Dalam RT-PCR, template RNA pertama dikonversi ke dalam DNA komplementer (cDNA) menggunakan suatu reverse transcriptase. cDNA kemudian digunakan sebagai template untuk amplifikasi secara eksponensial menggunakan PCR biasa. RT-PCR saat ini merupakan metode/teknik yang paling sensitif dalam deteksi RNA yang tersedia. Penggunaan RT-PCR untuk deteksi RNA transkrip telah merevolusi studi mengenai ekspresi gen dalam beberapa pemikiran sebagai berikut :

·      Secara teoritis memungkinkan untuk mendeteksi transkrip setiap gen secara praktis

·      Memungkinkan amplifikasi dan eliminasi sampel yang diinginkan untuk kebutuhan akan kelimpahan materi

·      Menyediakan toleransi untuk degradasi RNA selama RNA yang mencakup primer utuh

RT-PCR

 

Alur Teknik RT-PCR

 

Terima Kasih sudah bekunjung di blog labbiomolekuler ini...

Dalam blog ini akan Kami share segala sesuatu seputar biologi molekuler

Kami pun menyediakan segala keperluan laboratorium biologi molekuler (khususnya) dan laboratorium umum...

Untuk info lebih lanjut, silahkan kunjungi link di bawah ini :

www.biosm-indonesia.com 

Real-Time PCR (qPCR)

Real-Time PCR (qPCR)

PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Jika dialih bahasakan ke dalam Bahasa Indonesia menjadi reaksi berantai menggunakan aktivitas enzim Polymerase. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil.

Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction), adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa.

Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan.

Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.

Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :

(1) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green, dan

(2) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.   

 Prinsip Real Time PCR (qPCR)

Terima Kasih sudah bekunjung di blog labbiomolekuler ini...

Dalam blog ini akan Kami share segala sesuatu seputar biologi molekuler

Kami pun menyediakan segala keperluan laboratorium biologi molekuler (khususnya) dan laboratorium umum...

Untuk info lebih lanjut, silahkan kunjungi link di bawah ini : 
www.biosm-indonesia.com